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国家社自科基金青年面上成功中标申请书范文模板:纤维化细胞06

(3)镜下观察上述各组小鼠肝组织形态学改变:

① 取1克肝组织,常规固定、石蜡切片、HE染色,在普通光镜下观察肝的病理组织学改变情况并摄片;取1㎜3大小肝组织,固定、脱水、包埋、烤干、切片,在透射电镜下观察并摄片(注意观察凋亡小体的形态及数量);

虫卵肉芽肿大小、数量检测:以此作为肉芽肿炎性反应程度的一个指标。更加具体的详情细节请前往秋天网站评分学术版块。取1克肝组织,10%甲醛固定,石蜡包埋,切片厚约4~5μm,HE染色。应用医学图像分析系统测量切片中所有含完整毛蚴的单虫卵肉芽肿面积,用标准计算纸测量肝组织面积,全部数据输入计算机,计算以下指标:a.虫卵肉芽肿大小:包括虫卵肉芽肿截面面积(mm2/个)和体积(mm3/个);b.虫卵肉芽肿数量:即单位面积肝组织内虫卵肉芽肿的数量(个/cm2);

③ 肝组织虫卵计数:以此作为小鼠感染程度的一个指标。称取肝组织1g,剪碎,置于小烧杯中,加入50g/L的KOH 10ml,于37℃孵箱中消化12 h(过夜),直至组织消化完全,搅匀,吸取100μl,涂片4张,加盖玻片在显微镜下计数全部4张涂片虫卵数,再乘以100,即为虫卵数/g肝组织(EPG)。以EPG值乘以每只小鼠的肝脏重量,即为肝脏虫卵总数;

④ 在普通显微镜下对肉芽肿内嗜酸性粒细胞进行计数,并计算各组均值,以此作为肉芽肿炎性反应程度的另一个指标;

⑤ 用免疫组织化学法(PicTure二步法)检测肝组织中IL-4、IFN-γ、TGFβ1及其受体、PDGF及其受体、NFκB(p65)、Bcl-2、Bax 、MMP13、TIMP1表达情况。每批实验均设立阴、阳性对照。采用MetaMorph显微图象分析系统对图象定量分析。

⑥ 用免疫组织化学法检测激活的HSC:肝组织切片在室温下与抗α-SMA单抗对切片孵育30分钟后,再与抗鼠IgG2a-过氧化物酶结合物反应,用DAB显色、苏木精、伊红复染。光镜下激活的HSC呈棕褐色。用MetaMorph显微图象分析系统对图象进行定量分析,了解HSC被激活的情况;

⑦ 用Van Gieson苦味酸-酸性品红法对肝组织切片进行染色,胶原纤维呈红色,肌纤维、胞浆和红细胞呈黄色,细胞核呈蓝黑色。用MetaMorph显微图象分析系统进行定量分析,以此来判断、比较肝纤维化程度;

(4)分离、培养肝组织中的HSC:小鼠在给予麻醉、抗凝后,无菌下以16号套管针作门静脉插管,灌注D-Hanks液至肝脏充盈,剪开下腔静脉放血后结扎。用另一个16号套管作上腔静脉插管,形成门静脉-上腔静脉循环。分别以0.1%链霉蛋白酶E、0.03%Ⅰ型胶原酶灌注3~4分钟后取出肝脏、剪碎,用链霉蛋白酶E、DNA酶消化后,200目筛网过滤、Percoll密度梯度离心、无血清RPMI1640培养液培养。在光镜下培养原代肝星状细胞呈星形或多边形,胞浆丰富,内含脂滴而激活的肝星状细胞脂滴减少或消失,有的细胞变成梭形。更加具体的详情细节请前往秋天网站评分学术版块。用台盼蓝排斥实验检测HSC活力;

(5)用流式细胞仪检测各组HSC的DNA含量,分析细胞凋亡指数,了解药物对HSC凋亡的影响;

(6)用Western blot 法分别检测HSC中Smad3、7和 ERK的含量(采用凝胶成像系统扫描,以特异性条带浓度与面积的乘积为有效值,反映蛋白表达水平),以了解虫卵肉芽肿及药物对HSC信号转导通路中蛋白激酶的影响;

(7)提取HSC中的总mRNA,用RT-PCR法分别检测HSC中的Ⅰ、Ⅲ型胶原mRNA的表达,以了解肝纤维化时药物对Ⅰ、Ⅲ型胶原的影响;

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